0蛋白AG融合蛋白琼脂糖凝胶 ProteinAG

蛋白A蛋白G琼脂糖凝胶FF
（Protein AG-Berpharose FF） 产品介绍 蛋白A蛋白G琼脂糖凝胶FF是将重组蛋白A蛋白G融合蛋白键合在琼脂糖凝胶微球上形成的亲和分离介质。同单独的蛋白A或蛋白G分离介质相比，具有更宽广的结合范围，同时融合后的r-PAG降低了对pH值的依赖，允许在pH5-8进行结合。本产品多用于免疫沉淀
（IP)以及免疫共沉淀
（Co-IP)研究，及抗体固定及其它相关研究。 规格 1ml
（预装柱）、5ml
（预装柱）、10ml
（预装柱）、25ml、100ml、500ml 纯化流程 以免疫共沉淀
（Co-IP）举例： 结合缓冲液：20mM磷酸缓冲液、150mMNaCl、pH7.0 洗脱缓冲液：0.1M甘氨酸，PH3.0 中和缓冲液：1 M Tris-HCl，pH 8.5
（
注：所用过柱液体在使用之前建议用至少小于等于0.45μm滤膜过滤）
（
1)样品预处理：细胞、植物、动物组织裂解液样品，最终总蛋白浓度选择在0.5-1.0ug/ul范围内为宜，上样前要确保样品溶液拥有合适的离子强度和pH值
（如：可以用结合缓冲液对样品液进行稀释或透析）；哺乳动物细胞内有多种成分可以和IgG发生结合，可能会在后续免疫印迹中出现非特异性条带，可通过加入Normal IgG和Protein AG-Berpharose FF的方式预处理裂解液样品，以降低非特异性结合。
（2）抗原-抗体复合物制备：将抗体与含有目的蛋白的裂解液混合，室温震荡孵育30-60min
（或4-8度孵育过夜），形成抗原-抗体复合物
（可根据已优化好的抗原抗体结合条件处理）。
（注意：抗体的加入量要依据填料量，抗体的加入量过多会影响到抗原-抗体混合物与填料的结合，故建议抗体加入量为填料载量的80%）
（
3)填料平衡：取适量的Protein AG Berpharose FF加入到2ml离心管中，500 r离心1min，弃上清，加入0.5ml结合缓冲液，悬浮填料，500 r离心1min，弃上清，重复两次。
（4）抗原-抗体复合物的吸附：将抗原-抗体复合物加入到平衡好的填料中，均匀，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，促使样品和填料充分接触并吸附，约30min后，500 r离心1min，取上清液，留样检测。
（5）除杂清洗：向上述离心管中加入0.5ml的结合缓冲液，悬浮填料，进行清洗，500 r离心1min，吸弃上清，重复两次。
（6）抗原洗脱： ①非变性洗脱法
（洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析）：向离心管中加入5倍柱体积的洗脱缓冲液，用移液器吹打5次，混匀，然后在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管10min后，500 r离心1min，吸取上清液，收集洗脱组分，即为目标抗原，收集上清液至新的离心管中，并立即加入十分之一体积的中和缓冲液中和缓冲液调节其pH至中性，用于后期功能分析。 ②变性洗脱法
（洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测）：向离心管中加入25ul 1×SDS-PAGE Loading Buffer混合均 匀，95℃加热5min。然后进行离心，200 r离心1min，收集上清液，进行SDS-PAGE电泳，转膜后进行 Western分析。