木聚糖酶检测试剂盒(DNS 微板法)的计算
发布时间:2023/12/22 9:56:40 已浏览次数: 126 次

 木聚糖酶检测试剂盒(DNS 微板法)的计算

产品简介：

木聚糖(Xylan)是植物细胞壁的主要组成成分，它也是可利用的丰富的半纤维素。木聚糖酶(Xylanase)指能专一降解半纤维素、木聚糖为低聚木糖和木糖的一组酶的总称。木聚糖酶主要来源于细菌和真菌，包括厌氧菌、需氧菌、嗜温微生物、嗜热微生物和极端微生物等。

木聚糖酶主要包括 3 类：①β-1,4-D-内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)，从木聚糖主链的内部切割β-1，4 糖苷键，使木聚糖溶液的黏度迅速降低；②β-1,4-D-外切木聚糖酶(EC3.2.1.92)，以单个木糖为切割单位，作用于木聚糖的非还原性末端，使反应体系还原性不断增加；③β

-木糖苷酶(EC3.2.1.37)，切割低聚木糖，水解产物主要为木糖、木二糖及木三糖等低聚木糖。

根据酶的理化特性，木聚糖酶又可分为 2 大类：即分子量小于 30ku 的碱性木聚糖酶和

分子量大于 30ku 的酸性木聚糖酶。通常细菌可以同时产生酸、碱性木聚糖酶，但真菌通常只产生低分子量的碱性木聚糖酶。从本质上讲，木聚糖酶都具有外切酶和内切酶活性，只是活性高低不同而已。作为一种工业用酶制剂，木聚糖酶具有潜在的应用价值。首先木聚糖酶可以将农业和木材工业的废物中的木聚糖转化为木糖；其次，Wong 等建议木聚糖酶可应用在果汁澄清、咖啡、植物油和淀粉提取加工过程中。木聚糖酶检测试剂盒(DNS 微板法)检测原理是：木聚糖酶能将木聚糖降解成还原性寡糖和单糖，在沸水浴条件下可以与３,５-二硝基水杨酸(DNS)试剂发生显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此，通过测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中木聚糖酶的活力。本产品仅用于科研领域，不用于临床诊断或其他用途。

自备材料：

1、去离子水或蒸馏水

2、电子天平(精度 0.0001g)、pH 计、磁力搅拌器、移液器、小烧杯

3、振荡器、纱布、离心机、离心管或试管、三角瓶、容量瓶、

4、水浴锅、电热炉、培养箱、酶标仪、酶标板

操作步骤(仅供参考)：

1、配制木聚糖溶液：准确称取 0.15g 木聚糖，使充分溶解于 8ml 去离子和 5ml NH 水溶液(3×)中，通过 pH 计测定，用 YS 溶液调节 pH 至 5.5~5.6，补水至 15ml，木聚糖终浓度为 10mg/ml，4℃避光保存，48 小时有效。

2、配制 NH 水溶液(1×)：取 1 份 NH 水溶液(3×)和 2 份去离子水混合即成。

3、标准曲线绘制：取8支离心管按下表设置，准确吸取木糖标准(10mg/ml)与Assay buffer，

即得不同浓度的木糖梯度标准。

4、准备样品:

①固体样品按照下表中建议的称样量称取试样两份，精确至 0.001 g。 加入 4ml Assay

buffer，充分溶解，并定容至 10 ml，在 4 °C 条件下避光保存 1~2h。1000g 离心 3~5min，取上清液，再用 Assay buffer 做适当稀释、定容(稀释后的酶液中木聚糖酶活力最好能控制在 0.04~0.10U/ml 之间）。

②液体样品可以直接用 Assay buffer 稀释、定容(稀释后的酶液中木聚糖酶活力最好能控

制在 0.04~0.10 U/ml 之间）。如果样品稀释后酶液的 pH 偏离 5.4~5.7，需要用乙酸溶

液或氢氧化钠溶液校正至 5.4~5.7。

5、测定样品

①取适量的木聚糖溶液和酶提取液置于不同的离心管中，37°C 平衡 20 min；木聚糖溶

液使用之前应充分摇匀。

②取 2 支离心管按下表设置依次加入相应试剂：

计算：

木聚糖酶活力单位定义：在 37℃ pH5.5 的条件下，每分钟从浓度为 5mg/ml 的木聚

糖溶液中降解释放１μmol 还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位Ｕ。根据酶活性定义，可

计算出样品中的木聚糖酶活性。

以系列木糖标准(mg/ml) (1~7 号)为横坐标，以相应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

根据标准曲线计算出酶提取液(对照管和测定管)的吸光度相对应的木糖浓度 C，根据下式再

计算木聚糖酶活性。

D1= N×(C1-C0)×1000/(1×M×t)=N×(C1-C0)×1000/4506

D2=D1×V0/m

式中：D1——稀释酶液中木聚糖酶的活力，单位为 U/ml

N——样品稀释倍数

C1——样品测定管木糖浓度，单位为 mg/ml

C0——样品对照管木糖浓度，单位为 mg/ml

1000——转换因子，1mmol=1000μmol

M——木糖的摩尔质量，单位为 g/mol（=150.2）

t——酶与底物的反应时间，单位为 min（=30）

D2——固体样品中木聚糖酶的活力，单位为 U/g

V0——固体样品的酶提取液总体积，单位为 ml

m——称取样品的质量，单位为 g

注意事项：

1、 木糖标准应避免反复冻融，以免失效或效率下降。

2、 木聚糖易溶于碱性溶液中，加入 YS 溶液后呈悬浊状，静置后可能分层，为减少实验误差，后续实验使用时应摇匀。

3、 待测酶提取液样品如不能及时测定，应置于-20℃保存，3 天内稳定。

4、 如果样品酶活性过高，应用 Assay buffe 稀释酶提取液后重测，结果乘以稀释倍数。

5、 木聚糖酶的最适 pH 一般在 5.5。如果样品稀释后酶液的 pH 偏离 5.4~5.7，需要用乙酸溶液或氢氧化钠溶液校正至 5.4~5.7。

6、 本试剂盒适用于饲料等样品的木聚糖酶活性的测定。

7、 Assay buffer 如不够用，可用乙酸钠缓冲液(0.1mol/L,pH5.5-6.0)替代。

8、 DNS 试剂、NH 水溶液(2×) 和 YS 溶液有一定的腐蚀性和刺激性，应小心操作。

9、 沸水浴实验操作时，应当选择带螺旋盖的离心管。

10、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：6 个月有效。低温运输，按要求保存。

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