WB实验代测的实验流程
发布时间:2023/10/7 10:39:57 已浏览次数: 128 次

WB实验代测的实验流程

蛋白质免疫印迹法 (Western Blot ) ，简称WB ，是指通过SDS-PAGE胶将不同分子量的蛋白质分离开，然后将目标蛋白转移到载体(PVDF)膜上，利用抗原抗体的特异性结合，用特异性的一抗结合目标蛋白，用HRP标记的二抗结合一抗，再加以ECL发光液显色，检测组织或者细胞内某种或者某些特异性蛋白质的表达。蛋白质免疫印迹是做蛋白质分析的一种常规技术，常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析，还可以用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。

　实验流程：

　　蛋白提取-制胶-电泳-转膜-封闭-一抗孵育-二抗孵育-化学发光-结果分析;

送样运输要求：

　　新鲜组织，100mg以上，干冰运输。

　　细胞量为5*10^6以上，收集细胞沉淀，干冰运输。

折叠试剂准备

1、SDS-PAGE试剂:见电泳实验。

2、匀浆缓冲液:1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml;10%SDS 6.0ml;β-巯基乙醇 0.2ml;ddH2O 2.8ml。

3、转膜缓冲液:甘氨酸 2.9g;Tris 5.8g;SDS 0.37g;甲醇200ml;加ddH2O定容至1000ml。

4、0.01M PBS(pH7.4):NaCl 8.0g;KCl 0.2g;Na2HPO4 1.44g;KH2PO4 0.24g;加ddH2O至1000ml。

5、膜染色液:考马斯亮兰 0.2g;甲醇80ml;乙酸2ml;ddH2O118 ml。包被液(5%脱脂奶粉，现配):脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。

6、显色液:DAB 6.0mg;0.01M PBS 10.0ml;硫酸镍胺 0.1ml;H202 1.0μl。

WB实验代测的实验流程