Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)操作说明
发布时间:2023/8/21 14:59:02 已浏览次数: 178 次

 Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)操作说明

产品介绍：

Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)是一种在非变性条件下裂解细胞或组织样品从而制备蛋白样品的裂解液。本细胞裂解液裂解的细胞或组织样品，可以用于PAGE，Western，免疫沉淀(immunol precipitation，IP)，免疫共沉淀(co-IP)和ELISA等，以及许多兼容1% Triton X-100的酶活性或者生物小分子的检测。使用本裂解液时，用户可以根据具体用途自行添加特定抑制剂或者不添加抑制剂。
本产品可以用于动物、植物的细胞或组织样品，也可以用于真菌或细菌样品。

操作方法：

对于培养细胞样品：

1、融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，根据需要自行确定添加适当的抑制剂或不添加抑制剂。

2、对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。

对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。

3、充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入100微升裂解液即可，但如果细胞密度非常高可以适当加量到150微升或200微升。每100万细胞用100微升本产品裂解后获得的上清，其蛋白浓度约为2-4mg/ml，不同细胞有所不同。

对于组织样品：

1、把组织剪切成细小的碎片。

2、融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，根据需要自行确定添加适当的抑制剂或不添加抑制剂。

3、按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)

4、用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。

5、充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。每20mg冻存的小鼠肝脏组织用200微升本裂解液裂解后获得的上清，其蛋白浓度约为15-25mg/ml，不同状态的不同组织有所不同。

6、如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈涡旋使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。

注意事项：

1、如需添加蛋白酶抑制剂等，需自行准备。

2、裂解样品的所有步骤都需在冰上或4℃进行。

3、对于某些特殊蛋白的IP，若Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)或NP-40裂解液。如果IP的时候背景很高，则应考虑选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液(强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液 (弱)或NP-40裂解液。

4、对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液 (P0013)效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。

5、本产品仅供科研实验用，不做其它用途。

6、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。