琼脂糖-重组耐碱蛋白A 亲和填料的使用参考方法
发布时间:2024/9/9 10:50:56 已浏览次数: 139 次

琼脂糖-重组耐碱蛋白A 亲和填料的使用参考方法

产品介绍

rat-PANUPharoseFF是一款抗体亲和填料，FF为Fast Flow的缩写，意味该填料可在高流速下工作。

重组耐碱蛋白A配基由大肠杆菌表达，不含动物来源。rat-PANUPharoseFF的基球与配基通过单点偶联而成，加之基因工程改造，其对人IgG 的动态结合载量稳定在45mg/mL，可耐受0.1~0.5M浓度的NaOH溶液清洗和去除热源，纯化过程具备配基掉落少、宿主细胞蛋白含量低的特点。相较于ProA NUPharose FF，本产品保持了对人、小 鼠、大鼠、兔、牛等等来源的多种类型和亚型的抗体有亲和作用，可从腹水、血清、细 胞培养上清或细胞抽提物中分离和纯化多种哺乳动物不同亚型的抗体或包含抗体Fc片段的基因工程重组蛋白，可满足不同规模的研究或生产严格的清洁要求。

色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定体积。rat-PANUPharoseFF的压缩比为1.15。为使达到装柱比，可通过柱头下压的方法，也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽滤除去液体，并用约3倍填料体积的纯化水洗涤，重复3次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成50~75 v%的装柱填料悬液，使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器），为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后，用装柱液将装柱器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处；通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过0.3MPa），继续压柱至界面清晰稳定，标记界面稳定时的柱高。停泵，打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后，需用高流速平衡柱内的填料。

洗脱与再生（Elution & Regeneration）

最常用的洗脱方式为pH=2.5~4.0的甘氨酸、柠檬酸盐或乙酸盐，该条件可基本将抗 体完全洗脱。但该pH较低，可能会使一些抗体失活或聚集，在条件筛选阶段可逐步降低pH，筛选出收率可接受、抗体不失活或不聚焦的最高pH。也可以将洗脱液收集在弱碱性的缓冲液中，中和至中性，以缩短低pH条件的接触时间。洗脱之后，可用5~10个柱体积的洗脱液对色谱柱进行再生。